Problème
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Cause
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Suggestions
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Transfert médiocre de protéines
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L’équipement de transfert a été assemblé de manière incorrecte et les protéines se déplacent dans la mauvaise direction
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- Il est possible que le sandwich gel / membrane ait été assemblé dans le mauvais sens, ou qu’une cassette ait été insérée avec la mauvaise orientation. Vérifiez la polarité
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Le système de détection Western ne fonctionne pas ou n’est pas suffisamment sensible
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- Incluez un antigène de contrôle positif ou négatif approprié. Consultez le manuel d’utilisation
- Utilisez des marqueurs protéiques avec des bandes de référence colorées pendant la PAGE
- Colorez le gel au Coomassie ou colorez la membrane au Ponceau S
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Temps de transfert trop court
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- Augmentez le temps de transfert
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Réglage de puissance trop faible
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- Vérifiez l’intensité au début de l’utilisation Il est possible que l’intensité soit trop faible pour un réglage de tension donné. Augmentez l’intensité si nécessaire mais ne dépassez PAS 2 000 mA
- Il est possible que le tampon ait été mal préparé – préparez un nouveau tampon et augmentez la tension
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Rapport charge/masse incorrect pour les transferts d’origine
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- Protéines proches du point isoélectrique (pI). Modifiez le pH du tampon afin qu’il soit supérieur ou inférieur d’au moins 2 unités de pH par rapport au pI de la protéine concernée
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L’alimentation électrique utilisée est défectueuse ou inadaptée
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- Vérifiez le fusible d’alimentation Assurez-vous que la sortie de courant max. de l’alimentation électrique est d’au moins 2 000 mA
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Excès de méthanol limitant le transfert
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- Réduisez la concentration de méthanol pour maximiser le transfert de protéines depuis le gel, mais sans réduire la concentration au point d’empêcher la liaison à la nitrocellulose. Une autre solution est de réduire la concentration de méthanol et de passer à du PVDF
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Précipitation de protéines dans le gel
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Précipitation de protéines dans le gel
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- Utilisez du SDS dans le tampon de transfert (le SDS peut accroître l’efficacité du transfert, mais il peut également réduire l’affinité de liaison de la nitrocellulose et affecter la réactivité protéines/anticorps).
- Enlevez l’alcool du tampon de transfert
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Remous ou bandes manquantes ; transferts diffus
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Contact médiocre entre le gel et la membrane. Des bulles d’air ou un surplus de tampon restent entre la membrane et le gel
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- Enlevez délicatement les bulles d’air entre le gel et la membrane à l’aide d’un rouleau
- Utilisez davantage de papier-filtre ou un papier-filtre plus épais dans le sandwich gel/membrane.
- Remplacez les compresses en fibre, car elles s’usent avec le temps et restent comprimées de manière permanente
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La membrane n’est pas totalement mouillée ou elle a séché
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- Si le trempage n’a pas lieu immédiatement après l’immersion dans le tampon de transfert, chauffez de l’eau distillée juste sous le point d’ébullition et trempez la membrane jusqu’à ce qu’elle soit totalement mouillée
- Si vous utilisez du PVDF, immergez la membrane dans du méthanol avant de tremper le tampon de transfert
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Problème lié à l’électrophorèse sur gel
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- Une mauvaise polymérisation du gel
- Des conditions de fonctionnement inappropriées
- Une contamination du tampon
- Une application excessive d’échantillon contribuent toutes à une mauvaise qualité de gels et de transferts
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Motif de la cassette de gel transféré au blot
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Compresses en fibre contaminées
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- Remplacez les compresses en fibre ou nettoyez soigneusement. Tampon de transfert contaminé
- Remplacez les solutions de tampon
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Liaison médiocre entre la membrane et la nitrocellulose
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Excès de méthanol limitant le transfert
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- Assurez-vous que la concentration de méthanol ne dépasse pas 20 % (v/v)
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Il est possible que des protéines soient transférées à travers la nitrocellulose
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- Utilisez du PVDF ou de la nitrocellulose à porosité plus petite (0,2 µm)
- Ajoutez de la nitrocellulose supplémentaire sur la membrane pour déterminer si les protéines migrent directement à travers la membrane au contact du gel
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Les protéines < 15 kDa ont une liaison réduite à la nitrocellulose 0,45 µm ou peuvent être éliminées de la membrane lors des tests
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- Utilisez du PVDF ou de la membrane en nylon, qui ont des capacités de liaison supérieures
- Utilisez du détergent Tween 20 lors des étapes de lavage et d’incubation des anticorps. Réduisez ou éliminez les étapes de lavage les plus exigeantes
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Le SDS dans le tampon de transfert réduit l’efficacité de liaison
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- Réduisez ou éliminez la concentration de SDS
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La membrane n’est pas totalement mouillée
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- Les zones blanches sont des zones sèches où les protéines ne pourront pas se lier
- Si le trempage n’a pas lieu immédiatement après l’immersion dans le tampon de transfert, chauffez de l’eau distillée juste sous le point d’ébullition et trempez la membrane jusqu’à ce qu’elle soit totalement mouillée
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Liaison médiocre entre la membrane et le PVDF
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La membrane n’est pas totalement mouillée
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- En raison de l’hydrophobie du PVDF, la membrane doit être complètement trempée dans le méthanol avant l’équilibrage du tampon aqueux
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Il est possible que des protéines soient transférées à travers la membrane
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- Si vous transférez dans des conditions de haute intensité, réduisez la tension
- Ajoutez du PVDF supplémentaire sur la membrane pour déterminer si les protéines migrent directement à travers la membrane au contact du gel
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Il est possible que la membrane ait séché lors de la manipulation
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- Les membranes totalement mouillées ont un aspect gris translucide Des zones blanches se formeront à la surface si l’on n’a pas laissé la membrane sécher. Étant donné que les protéines ne pourront pas se lier à des zones sèches, retrempez la membrane dans du méthanol et rééquilibrez dans le tampon de transfert
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Le SDS dans le tampon de transfert réduit l’efficacité de liaison
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- Réduisez ou éliminez la concentration de SDS
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Puissance
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La puissance est trop élevée
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- Vérifiez toujours l’intensité au début de l’utilisation, car il est possible que l’intensité soit trop élevée pour un réglage de tension donné. Une préparation de tampon inappropriée peut également entraîner une conductivité élevée et une génération de puissance excessive. Le réglage de l’intensité ne doit pas dépasser 2 000 mA
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Détection immunospécifique
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Bruit de fond élevé
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- Réduisez la concentration d’anticorps/protéines de l’échantillon
- Bruit de fond trop faible
- Réduisez la concentration d’anticorps / la concentration de protéines de l’échantillon
- Consultez le manuel inclus avec le kit de détection des anticorps
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Détection des protéines totales
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Détection des protéines totales
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- Consultez le manuel du kit de coloration ou de détection
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